右美托咪定对严重烫伤大鼠心肌损伤的影响及其机制的研究

【摘要】右美托咪定(dexmedetomidine)是一种高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂,具有中枢性抗交感和抗焦虑作用,能产生近似自然睡眠的镇静作用；同时具有一定的镇痛、利尿作用,对呼吸无明显抑制。自1999年美国FDA批准其用于ICU机械通气患者最初24h的镇静以来,已经在临床手术麻醉、围术期及重症监护室镇静镇痛等领域得到广泛的应用。国外有学者报道,右美托咪定可应用于烧伤患者的手术与换药,但其在烧伤领域的应用还不够广泛。右美托咪定对烧伤后机体病理生理过程的影响及相关机制目前也尚未完全阐明。心脏是机体的循环动力器官。有研究表明,严重烧伤后10min,心肌细胞骨架受损,30min至1h心肌血流量开始明显减少,心功能降低,肌钙蛋白漏出增多,病理形态出现明显变化,心肌细胞凋亡增加。这种即早出现的心肌损害不仅可引起心功能不全,还可能成为严重烧伤休克和全身组织器官缺血缺氧损害的重要启动因素。因此,针对烧伤后心肌损害机制的研究和如何防治严重烧伤后心肌损害一直是国内外学者的研究热点。右美托咪定的主要药理作用是降低交感神经系统的兴奋性,削弱应激反应,减少应激激素的分泌,并预防围术期心肌缺血的发生。国外有研究表明,右美托咪定预处理可减轻心肌缺血再灌注损伤；国内也有学者研究发现,右美托咪定预处理可以减轻缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡。另外,还有大量基础研究表明,右美托咪定可以通过减轻机体炎症反应,产生器官保护作用。右美托咪定对烧伤后心肌损伤的影响及机制如何,目前尚不清楚。由于严重烧伤后心肌损害的机制包括：机体过度的应激反应、心肌细胞缺血缺氧、缺血再灌注损伤、失控性炎症反应、氧利用及能量代谢障碍等,并且心肌细胞出现不同程度的凋亡。因此,我们推测右美托咪定对烧伤后心肌细胞可发挥类似的保护及抗凋亡作用。目前,已有大量研究证实心肌细胞凋亡是严重烧伤早期心功能损害的原因之一,但具体机制尚未完全阐明。传统的细胞凋亡途径主要包括死亡受体和线粒体途径,两者均通过诱导caspase级联反应激活caspase-3,导致细胞凋亡。近年的研究显示,内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)也与细胞凋亡密切相关。在ERS早期,细胞通过一系列蛋白表达调控—-未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse,UPR)以恢复内质网稳态；但如果ERS持续而严重,则激活凋亡通路而诱发细胞凋亡。有研究表明,减轻ERS的药物或者措施可以减少缺血再灌注损伤引起的心肌损伤及凋亡。如果右美托咪定能减轻烧伤后心肌损伤,其机制是否与影响心肌细胞凋亡有关?是否有涉及ERS介导的凋亡通路?这些均有待进一步研究探讨。ERS是真核细胞内自我保护机制的一种反应,对维持细胞内环境稳态具有重要作用,其过程及介导凋亡的通路十分复杂。葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78,GRP78)是内质网分子伴侣,是UPR反应的标志分子之一,也是调控ERS的关键分子之一。没有未折叠或错误折叠蛋白质时,GRP78能结合并抑制内质网应激的特殊感受器,一旦出现未折叠蛋白质,GRP78就从感受器上移位到未折叠蛋白上,使感受器得以激活。蛋白激酶R样内质网激酶(PKR-LikeERkinase,PERK)是内质网应激最重要的感受器。ERS时,与PERK结合在一起的GRP78由于位移到大量的未折叠和错误折叠蛋白质上,而使得PERK蛋白暴露,进而发生二聚化和自身磷酸化。磷酸化的PERK又使得内质网外侧的eIF2a发生磷酸化修饰,从而使得蛋白质合成启动过程暂停,缓解了蛋白质的进一步堆积。如果ERS持续存在,磷酸化的PERK则通过ATF4激活下游的相关凋亡通路,诱导细胞凋亡。因此,GRP78与P-PERK表达的上调标志着ERS的发生,并且可以反映ERS激活的程度。C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologousprotein,CHOP)是ERS特异的转录因子,是ERS发挥介导细胞凋亡功能的最主要蛋白。正常情况下,CHOP表达十分低下,当ERS持续剧烈存在时,IRE1、PERK、ATF6的活化均对CHOP产生诱导,促使其激活,并大量表达,从而诱导细胞凋亡,其中PERK通路与CHOP的活化关系最为密切,因为PERK-eIF2a-ATF4是CHOP蛋白表达所必须的复合物。Caspase-12是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成员之一,位于内质网膜胞质一侧。Caspase-12只有被激活后才发挥介导凋亡的作用。目前相关研究表明,有三种途径可以激活Caspase-12:IRE1途径,m-钙蛋白酶途径和Caspase-7途径,而这三种途径均与ERS有关。烧伤后心肌细胞ERS的具体过程尚未完全阐明,右美托咪定对上述ERS标志性蛋白的影响如何也有待研究探讨。综上所述,本研究拟以SD大鼠为研究对象,并建立大鼠30%体表面积烧伤模型,应用组织病理学、免疫组织化学、蛋白质电泳等分子生物学手段,比较不同剂量右美托咪定对严重烫伤大鼠心肌损伤及炎症状态的影响,观察严重烫伤大鼠整个休克期ERS相关的标志性蛋白及心肌细胞凋亡水平的变化及趋势,并进一步探讨右美托咪定对严重烫伤大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制,为将来深入阐明右美托咪定对严重烧伤后心肌损伤的影响机制以及右美托咪定在烧伤患者围术期的广泛应用提供重要的理论依据。第1章右美托咪定对严重烫伤大鼠血清cTnI、CK-MB、TNF-α以及心肌组织TNF-α的影响目的探讨不同剂量右美托咪定对烫伤大鼠心肌损伤及炎症反应的影响。方法以SD大鼠为研究对象,将其分为3组(n=32)：烫伤组(A组)、烫伤+右美托咪定10μg/kg组(B组)、烫伤+右美托咪定30μg/kg组(C组)。建立大鼠30%体表面积烧伤模型后,按Parkland公式补液,分别用相应剂量右美托咪定腹腔注射处理,于伤后3、6、12、24h,检测大鼠心肌组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及血清肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、TNF-α水平变化。数据资料以x±s表示,采用SPSS17.0统计软件分析。不同处理组在各时间点测得的相应指标水平比较采用两因素析因设计资料的方差分析,组间比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。结果A、B、C三组大鼠烫伤后血清cTnI、CK-MB、TNF-α以及心肌组织TNF-α水平逐渐升高,伤后12h达高峰,伤后24h出现下降趋势(P<0.05)。与A组比较,B组、C组大鼠血清cTnI水平下降,且C组下降较B组更显著(P均<0.05)；伤后6、12、24hB组大鼠血清CK-MB水平较A组下降(P均<0.05),伤后3、6、12、24hC组大鼠血清CK-MB水平较A组下降(P均<0.05),伤后3、12、24hC组大鼠血清CK-MB水平显著低于B组(P均<0.05)；伤后12hB组大鼠血清TNF-α水平较A组下降(P=0.019),伤后3、6、12、24hC组大鼠血清TNF-α水平较A组下降(P均<0.05),伤后6、12、24hC组大鼠血清TNF-α水平显著低于B组(P均<0.05)；伤后6、12、24hB组大鼠心肌组织TNF-α水平较A组下降(P<0.05),伤后6、12、24hC组大鼠心肌组织TNF-α水平较A组下降(P均<0.05),伤后12hC组大鼠心肌组织TNF-α水平显著低于B组(P=0.00)结论严重烫伤后早期大鼠出现心肌损伤,于烫伤后12h血清cTnI、CK-MB、TNF-α以及心肌组织TNF-α水平达到峰值。右美托咪定可减轻大鼠烫伤后心肌损伤并降低血浆及心脏局部TNF-α水平,且腹腔注射301μg/kg所产生的心肌保护效应较腹腔注射10μg/kg显著。第2章严重烫伤大鼠早期心肌细胞凋亡以及心肌组织GRP78、P-PERK、CHOP表达的变化及意义目的观察大鼠严重烫伤后心肌细胞内质网应激相关蛋白表达的变化,探讨其在心肌细胞凋亡过程中的意义及可能机制。方法健康成年雄性SD大鼠64只,将其分为8组(n=8)：正常对照组、烫伤后1、3、6、12、24、48、72h组。建立大鼠30%体表面积烧伤模型后,按Parkland公式补液。对照组大鼠于假伤后即刻,其余7组大鼠于相应时间点获取左室心肌组织,采用蛋白印记以及细胞凋亡的原位标记(TUNEL)法,观察大鼠心肌组织GRP78、P-PERK、CHOP表达以及心肌细胞凋亡程度的变化。计量资料以x±s表示,采用SPSS17.0统计软件分析。各指标数据采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果各组大鼠心肌GRP78水平表达有差异(F=133.240,P=0.000),烫伤后大鼠心肌GRP78水平较伤前升高,差异有统计学意义(P<0.01),与伤后1、3、72h相比,伤后6-48h大鼠心肌GRP78进一步升高(P<0.01),从均值上看伤后48h大鼠心肌GRP78表达水平达到峰值,但伤后6-48h之间大鼠心肌GRP78表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠心肌P-PERK水平表达有差异(F=154.733,P=0.000),烫伤后3h开始大鼠心肌P-PERK水平较伤前逐渐升高,并于伤后12h-24h达到峰值水平,差异有统计学意义(P<0.01),而后逐渐回落,伤后72h恢复至伤前水平(P>0.05)。各组大鼠心肌CHOP水平表达有差异(F=223.871,P=0.000),烫伤后6h开始大鼠心肌CHOP水平较伤前逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01),并于伤后12h达到峰值水平,差异有统计学意义(P<0.01),而后逐渐回落,伤后72h恢复至伤前水平(P>0.05)。各组大鼠心肌细胞凋亡水平有差异(F=322.860,P=0.000),烫伤后1h开始大鼠心肌细胞凋亡水平较伤前逐渐升高,并于伤后12h达到峰值水平,差异有统计学意义(P<0.01),而后逐渐回落,伤后72h仍高于伤前水平(P<0.05)。结论大鼠严重烫伤早期心肌细胞存在明显的凋亡,凋亡最高峰在伤后12h。严重烫伤后1h大鼠心肌细胞ERS相关蛋白表达开始逐渐增加,整个烫伤早期阶段心肌细胞内质网应激反应一直持续,并参与了部分的心肌细胞凋亡过程,且CHOP通路所介导的细胞凋亡可能于伤后6h开始,伤后12h达到高峰。第3章右美托咪定对严重烫伤大鼠心肌细胞凋亡及内质网应激介导凋亡通路相关蛋白的影响目的右美托咪定对烧伤后心肌细胞凋亡以及内质网应激介导凋亡通路相关蛋白的影响。方法健康成年雄性SD大鼠24只,将其分为3组(n=8)：对照组(C组)、烫伤组(B组)、烫伤+右美托咪定30μg/kg组(D组)。建立大鼠30%体表面积烧伤模型后,按Parkland公式补液,分别用相应剂量右美托咪定腹腔注射处理,于伤后12h获取心肌组织,通过光学显微镜、电子显微镜以及免疫组织化学、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)和蛋白印迹等方法观察右美托咪定对严重烫伤大鼠心肌组织病理形态与凋亡以及GRP78、P-PERK、CHOP、Caspase-12这些内质网应激相关蛋白表达的影响。计量资料以x±s表示,采用SPSS17.0统计软件分析。各指标数据采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果与C组比较,B组和D组大鼠心肌组织GRP78、P-PERK、CHOP、Caspase-12表达水平以及凋亡指数均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)；与B组比较,D组大鼠心肌组织GRP78、P-PERK、CHOP、Caspase-12表达水平以及凋亡指数均减少,差异有统计学意义(P<0.05),光镜下见C组大鼠心肌细胞结构正常,肌丝排列整齐,细胞界限清晰；B组大鼠心肌细胞水肿、间质充血、心肌纤维变性,横纹模糊不清甚至消失,出现广泛的肌纤维波浪状排列；D组大鼠心肌细胞少量水肿,心肌纤维排列基本正常,病变程度较B组有所减轻；电镜下见C组大鼠心肌细胞结构正常,肌丝、肌节排列整齐,线粒体未见肿胀,细胞核正常,核膜完整,间质未见水肿及炎症细胞侵润,毛细血管内皮细胞无肿胀,管腔内未见淤血及血栓形成；B组大鼠心肌细胞肌丝、肌节排列紊乱,结构模糊不清,肌浆网扩张明显,部分肌丝灶性溶解,部分节段细胞膜破坏,可见部分线粒体漏出及固缩,间质毛细血管内皮细胞肿胀；D组大鼠心肌细胞肌丝、肌节排列基本整齐,线粒体轻度肿胀,仅个别线粒体漏出,肌浆网轻度扩张,细胞膜基本完整无断裂,少量间质水肿,毛细血管内皮细胞大致正常。结论右美托咪定可以减轻严重烫伤大鼠心肌损伤及凋亡,并抑制心肌细胞内质网应激程度以及内质网应激介导的凋亡通路相关蛋白表达,其减少细胞凋亡的机制可能与抑制CHOP和caspase-12这两条凋亡通路有关。论文主要结论1、严重烫伤后早期大鼠出现心肌损伤,血浆cTnI及CK-MB水平升高,于烫伤后12h达到峰值。烫伤后大鼠全身及心肌局部出现炎症反应,血浆及心脏局部TNF-α水平升高,烫伤后12h达到峰值。右美托咪定可减轻大鼠烫伤后心肌损伤并降低血浆及心脏局部TNF-α水平,且腹腔注射30μg/kg所产生的心肌保护效应较腹腔注射10μg/kg显著。2、大鼠严重烫伤早期心肌细胞存在明显的凋亡,凋亡最高峰在伤后12h。严重烫伤后1h大鼠心肌细胞ERS相关蛋白表达开始逐渐增加,整个烫伤早期阶段心肌细胞内质网应激反应一直持续,并参与了部分的心肌细胞凋亡过程,且CHOP通路所介导的细胞凋亡可能于伤后6h开始,伤后12h达到高峰。3、右美托咪定可以减轻严重烫伤大鼠心肌损伤及凋亡,并抑制心肌细胞内质网应激程度以及内质网应激介导的凋亡通路相关蛋白表达,其减少细胞凋亡的机制可能与抑制CHOP和caspase-12这两条凋亡通路有关。
【作者】王惠枢；
【导师】徐世元；
【作者基本信息】南方医科大学，麻醉学（专业学位），2014，博士
【关键词】右美托咪定；凋亡；烧伤；心肌损伤；内质网应激；

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